C'est en 1912 qu’Hopkins publie sa découverte essentielle : ayant soumis des animaux de laboratoires à divers régimes, il démontre qu'une alimentation ne comportant que des protéines pures, des glucides, des graisses et quelques oligo-éléments ne permettent pas d'assurer la croissance des sujets. Cette observation l'amène à postuler l'existence dans les aliments d'infimes quantités de substances dont le rôle sur la vie et la croissance des tissus est déterminant. Ces substances hypothétiques, dont il ignore encore la nature, il les appelle « facteurs alimentaires auxiliaires » : elles seront plus tard appelées « vitamines. » C'est cet article qui lui valut (aux côtés de Christiaan Eijkman) le prix Nobel de physiologie ou médecine « pour sa découverte des vitamines stimulant la croissance », en 1929.

Au cours de la Première Guerre mondiale, Hopkins poursuit ses recherches sur la valeur nutritionnelle des vitamines et de la margarine : pour ce dernier aliment, il démontre, conformément à l'opinion en vigueur, que sa valeur nutritionnelle est inférieure à celle du beurre, car elle est carencée en vitamines A et D. C’est ainsi qu'en 1926, les industriels mirent sur le marché une margarine enrichie en apports vitaminés.

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