Neil Patrick Harris est né de parents originaires d'Irlande, tous deux avocats (mais reconvertis dans la restauration en 2004). Il a grandi à Ruidoso au Nouveau-Mexique. C'est en accompagnant son frère ainé à une audition qu'il est repéré, ce qui l'amène à jouer dans une pièce à l'école Le Magicien d'Oz. Il suit sa scolarité à l'école secondaire La Cueva d'Albuquerque (où Freddie Prinze Jr. a également étudié), où il est bon élève et joue dans des comédies musicales.

Depuis la préadolescence, il est passionné de magie, qui est devenue son passe-temps. Il est régulièrement l'hôte de soirées réservées aux magiciens, et est souvent sollicité pour faire preuve de son talent, sur les émissions de télévision ou encore dans ses rôles.

Il est surtout connu pour son rôle de jeune médecin surdoué dans Docteur Doogie et du coureur de jupons Barney Stinson dans How I Met Your Mother.

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